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[1] Roth, M J , N. Tanese , and S. P. Goff . "Purification and characterization of murine retroviral reverse transcriptase expressed in Escherichia coli. " Journal of Biological Chemistry 260.16(1985):9326.
[2] Kotewicz, Michael L , et al. "Isolation of cloned Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase lacking ribonuclease H activity." Nucleic Acids Research 16.1(1988):265-277.
StartScript II cDNA 第一链合成试剂盒含有两种经过优化的混合液：StartScript II 酶混合液和 StartScript II 反应混合液。酶混合液含 StartScript II 反转录酶和小鼠 RNase 抑制剂；反应混合液含 dNTP 和经优化的缓冲液。StartScript II 反转录酶是重组 M-MLV 反转录酶，降低了 RNase H 活性且提高了热稳定性。与野生型 M-MLV 反转录酶相比，StartScript II 反转录酶可在更高的温度下合成第一链 cDNA。该酶的活性温度高达 48℃，且具有特异性高、cDNA 产量高的特点。
该试剂盒还提供两种经优化的反转录引物与无核酸酶水污染的水。Oligo-dT 引物 [d(T)23VN] 能与 poly(A) 尾的起始端退火。经优化的随机引物混合液能随机并持续性地与整个 RNA 模板配对，包括 mRNA 与无 poly(A) 尾的 RNA。合成的第一链 cDNA 产物长度可达 10kb。
组分 | UA070076-50 Rxns | UA070076-250 Rxns |
StartScript II Reaction Mix (2X) | 600 μl | 5 x 600 μl |
StartScript II Enzyme Mix (10X) | 100 μl | 5 x 100 μl |
Random Primer Mix (60 μM)
| 110 μl | 5 x110 μl |
Oligo(dT)23 VN* (50 μM) | 110 μl | 5 x 110 μl |
RNase Free dH2O | 1 ml | 5 x 1 ml |
* V = A, G or C; N = A, G, C or T
1. 将RNA模板变性处理
在RNase-free离心管中配制如下混合液：
Number | Component | Volume |
1. Template RNA (One of the three is optional) | Total RNA Or poly(A) RNA/mRNA Or specific RNA | < 5 μg < 1 μg < 0.5 μg |
2. Primers (One of the three is optional) | Oligo(dT) 23 VN (50 μM) Or Random Primer Mix (60 μM) Or Specific Primer (1 μM) | 2 µl |
3. H2O | RNase Free dH2O | Up to 8 μl |
65°C加热5 min，迅速置于冰上骤冷，并在冰上静置2 min。
2. 配制第一链cDNA合成反应液
Component | Volume |
第一步的混合液 | 8 μl |
StartScript II Reaction Mix (2X) | 10 μl |
StartScript II Enzyme Mix (10X) | 2 μl |
用移液器轻轻吹打混匀。
3. 按下列条件进行第一链cDNA合成反应
将20 μl cDNA合成反应在42℃下孵育1小时。如果使用随机引物混合物，建议在42°C孵育前在25°C孵育5分钟。在80°C下使酶失活5分钟。cDNA产物应保存在-20°C。一般情况下，cDNA产物的体积不应超过PCR反应体积的1/10。
1. 使用DEPC处理研究中使用的所有设备，或购买经证明无核酸的设备。在研究过程中戴上手套，并经常更换，以避免RNA酶污染。
2. 确保所用试剂中没有RNA酶污染。
3. 为了保证逆转录反应的有效进行，有必要使用高质量的RNA模板。
4. Poly (A)+ mRNA不需要从总RNA中分离，但使用Poly (A)+ mRNA作为模板可以提高最终产物的产率和纯度。RNA的使用量，总RNA小于5 μg；Poly (A)+ RNA含量小于1 μg；特异性RNA小于0.5 μg。
5. cDNA产物应保存在-20°C。
6. 实验操作时应将酶放在冰上，实验结束后保存在-20°C。
从HEK293细胞中提取总RNA(1µg)，在20μl逆转录体系中进行逆转录。反转录后获得1μl的反转录产物，进行β_Actin cDNA 197bp片段的PCR扩增和电泳检测。以下为总RNA逆转录后的PCR检测效果。
Lane 1阴性对照-1（不添加PCR模板的阴性对照）；
Lane 2阴性对照-2（不添加酶混合液的阴性对照）；
Lane 3 One Test (UA)；
Lane 4 One Test (N公司)；
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