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phi29 聚合酶 RCA（滚环扩增）试剂盒包含了灵敏高效实现滚环扩增（RCA）所需的全部试剂，这是一种等温扩增方法，通过产生环状序列的长重复拷贝来连续扩增环状 DNA。该试剂盒包含phi29 DNA 聚合酶、dNTPs 和核酸外切酶抗性的随机引物（含有硫代磷酸酯键），确保了扩增环状 DNA 序列的通用性。起始材料可以是纯化的环状 DNA（单链或双链），或者直接使用液体培养基培养物、琼脂平板菌落和甘油菌，而不需要额外进行 DNA 提取。RCA 产物可直接用于下游应用，如 DNA 测序、细胞游离 DNA 富集、无细胞蛋白表达和 DNA 生物传感器。
Contain | UA070120-50 Rxns | UA070120-250 Rxns |
Phi29 DNA Polymerase (10 X) | 100 μl | 5 × 100 μl |
5 X RCA Reaction Buffer | 500 μl | 5 × 500 μl |
Exonuclease-Resistant Random Primers (500 µM) | 100 μl | 5 × 100 μl |
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix (10 mM) | 100 μl | 5 × 100 μl |
1. 如下表格所示，在不添加酶的情况下准备反应。通过移液或涡旋充分混合，但应轻柔。短暂离心以收集溶液至管底。
组分 | 体积 | 终浓度 |
5 X RCA Reaction Buffer | 4 μl | 1 X |
Exonuclease-Resistant Random Primers (500 µM) | 2 μl | 50 µM |
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix (10 mM) | 2 μl | 1 mM |
Circular DNA Template | X µl | 0.01-50 ng |
RNase Free dH2O | Up to 18 μl | - |
2. 在热循环仪中孵育，盖子设定为100°C，在95°C下孵育3分钟。然后让样品冷却至室温。
3. 将样品放在冰上，并向每个样品中加入2 µl的Phi29 DNA聚合酶。通过移液器或涡旋充分混合，但动作要轻柔。短暂离心以收集溶液到管底。
4. 在热循环仪中孵育，盖子设置在≥75°C，在30°C下孵育2小时，然后在65°C下孵育10分钟以灭活DNA聚合酶。RCA产物可以保存在4°C过夜或在-20°C长期储存。
1. RCA 扩增是利用 phi29 DNA 聚合酶链置换活性和持续合成能力的特性，对环状模板进行放大扩增。因此，其最佳底物为环状 ssDNA 或 dsDNA 模板（C-DNA）。除此外，其对分子量较大的线性模板（L-DNA）同样可以持续合成和放大扩增，如genomic DNA，此时其扩增放大比例弱于C-DNA 的扩增。
2. 由于高产量的高分子量DNA，RCA产品可能具有粘性。在使用任何下游应用之前，建议用无核酸酶水进行双倍稀释。
Phi29 Polymerase RCA Kit 和国外 N 公司的同类产品催化环状质粒 DNA pCMV-N-DsRed (4959bp) 扩增效果对比图（因产量高出现核酸挂孔拖尾现象，属于正常现象）。在 20ul 反应体系中，95 ℃孵育 3 min，冷却至室温后加入DNA 聚合酶，30 ℃孵育2 h，反应结束后，进行凝胶电泳检测其扩增效果。
M Marker
Lane 1阴性对照-1（未加DNA模板）；
Lane 2阴性对照-2（未加DNA聚合酶）；
Lane 3 One Test (UA070120)；
Lane 4 One Test (N公司)；
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