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组分 | UA070116-50 Rxns | UA070116-250 Rxns |
E. coli Poly(A) Polymerase (5 U/µl) | 100 μl | 5 × 100 μl |
10 X PAP Reaction Buffer | 300 μl | 5 × 300 μl |
10 mM ATP | 300 μl | 5 × 300 μl |
RNase Free dH2O | 1 ml | 5 × 1 ml |
1. 参考下表在冰浴中配制如下反应体系：
Component | Volume | Final Concentration |
10 X PAP Reaction Buffer | 5 μl | 1 X |
RNase Inhibitor (40U/μl) | 1.25 μl | 1 U/μl (Optional) |
E.coli Poly(A) Polymerase (5 U/μl) | 2 μl | 0.2 U/μl |
10 mM ATP | 5 μl | 1 mM |
RNase Free dH2O | Up to 50 μl | - |
用移液器轻轻吹打，充分混匀。
2. 加尾反应：37ºC孵育30 ~ 60 min。
3. 反应终止：反应完成后立即-20ºC保存，或加入EDTA至终浓度为10mM，或者使用苯酚/氯仿抽提并使用铵盐/乙醇沉淀RNA。
1. 由于涉及RNA操作，需要严格按照RNA操作的规范进行，避免RNase污染，相关试剂和耗材需要经过DEPC处理以去除RNase或者确保是RNase free的。
2. 用于加尾反应的RNA在使用前应进行适当的纯化，并溶解于RNase Free dH2O中，且溶液中应不含EDTA和盐分。
3. 如果较难确保比较严格的RNase-free，推荐在上述反应体系中添加适量的RNase Inhibitor，以提高溶液中RNA的稳定性。
4. 实验操作时应将酶制品全程放在冰上，实验结束后立即保存在-20°C。
Poly(A) Polymerase Tailing Kit对单链RNA添加Poly(A)尾的效果图。在50μl反应体系中，加入5 μg 541nt的单链RNA，以及图中指定量的Poly(A) Polymerase，37ºC孵育30 min，65ºC孵育20min终止反应。以下为琼脂糖凝胶电泳检测效果图。
Lane 1阴性对照（未加Poly(A) Polymerase）；
Lane 2 0.008 U PAP；
Lane 3 0.04 U PAP；
Lane 4 0.2 U PAP；
Lane 5 1 U PAP；
Lane 6 5 U PAP；
Lane 7 10 U PAP；
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